密理博ECL發(fā)光液的使用方法：

　　1.使用合適的方法進行Western，直至用PBST洗滌二抗。

 

　　2.新鮮配制ECL工作液：試劑I和試劑II按1:1混合后，用雙蒸水10倍稀釋，混合后即為ECL工作液。須立即使用。

 

　　3.印跡膜蛋白面朝上，用ECL工作液均勻滴加至印跡膜室溫孵育1-2分鐘。ECL工作液使用量大約為0.125ml/cm2膜或根據(jù)個人實驗習慣使用。

 

　　4.用平頭鑷夾住印跡膜，垂直置于吸水紙以吸去多余工作液。

 

　　5.快速將印跡膜置于二層保鮮膜之間，盡量趕盡氣泡。

 

　　6.將印跡膜蛋白面朝上，放于X光膠片暗盒內(nèi)。

 

　　7.在暗室內(nèi)放入X光片，曝光，顯影。

 

　　密理博ECL發(fā)光液的注意事項：

　?。?）可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

 

　?。?）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關系。曝光不足則條帶模糊。

 

　?。?）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

 

　?。?）由于密理博ECL發(fā)光液極其靈敏，強烈推薦大多數(shù)進口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。

 

　?。?）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質(zhì)量保鮮膜。

 

　　（6）使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

 

　?。?）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。